Projeto de um formato alternativo de fragmento de anticorpo que possa ser produzido no citoplasma de Escherichia coli

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 14188 (2023) Citar este artigo

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Com maior acessibilidade e penetração nos tecidos, formatos menores de anticorpos, como fragmentos de anticorpos (Fab) e fragmentos variáveis ​​de cadeia única (scFv), mostram potencial como escolhas eficazes e de baixo custo para anticorpos completos. Esses formatos derivados da arquitetura modular de anticorpos podem revelar-se revolucionários para certas aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Os hospedeiros microbianos têm se mostrado tremendamente promissores como hospedeiros de produção para formatos de fragmentos de anticorpos. No entanto, os baixos rendimentos da proteína alvo, juntamente com a complexidade do dobramento das proteínas, resultam em limitações de produção. Aqui, relatamos um formato alternativo de fragmento de anticorpo 'FabH3' projetado para superar alguns gargalos importantes associados ao dobramento e produção de Fabs. A molécula FabH3 é baseada no formato Fab com os domínios constantes substituídos por domínios CH3 de imunoglobulina G1 (IgG1) projetados capazes de heterodimerização com base na abordagem de direção eletrostática. Mostramos que este formato alternativo de fragmento de anticorpo pode ser produzido eficientemente no citoplasma de E. coli usando o sistema catalisado de formação de ligações dissulfeto (CyDisCo) em um estado nativamente dobrado com rendimentos solúveis mais elevados do que sua contraparte Fab e uma afinidade de ligação comparável contra o antígeno alvo.

Entre os bioterapêuticos, o segmento de anticorpos monoclonais (Mabs) detém uma posição dominante no mercado, no entanto esta tendência parece estar a mudar gradualmente com o desenvolvimento de novos formatos de anticorpos e novos medicamentos1. Os anticorpos monoclonais completos têm uma meia-vida circulante longa, o que pode torná-los inadequados para certas aplicações terapêuticas e diagnósticas2. Como uma solução potencial, os fragmentos de anticorpos (Fabs) surgiram como atores-chave na indústria biofarmacêutica. Eles oferecem certas vantagens, como penetração tumoral melhorada e profunda, ligação a epítopos específicos inacessíveis aos Mabs, ligação monovalente ao antígeno com imunogenicidade potencialmente reduzida, maior estabilidade do que formatos menores de fragmentos de anticorpos e depuração mais rápida3,4,5. Uma infinidade de aplicações de moléculas baseadas em anticorpos como agentes terapêuticos e de diagnóstico intensificaram a sua procura e, subsequentemente, a necessidade da sua produção com elevados rendimentos.

Muitos produtos biossimilares e do tipo “me-too” aprovados foram produzidos em sistemas de expressão microbiana, dos quais a E. coli continua a ser um hospedeiro de eleição6. Como os fragmentos de anticorpos Fab e scFv não são glicosilados e são relativamente pequenos, a sua produção em E. coli pode ser mais simples e economicamente mais viável do que os sistemas convencionais de cultura de células de mamíferos. Os fragmentos de anticorpos são proteínas ligadas por dissulfeto que são tradicionalmente produzidas de forma recombinante no periplasma oxidante ou como corpos de inclusão no citoplasma redutor de E. coli. No entanto, ambas as abordagens apresentam gargalos críticos na produção eficiente destas proteínas de interesse. A expressão periplasmática de Fabs resulta frequentemente em baixos rendimentos proteicos, principalmente devido à translocação proteica ineficiente e ao pequeno volume do periplasma, enquanto a expressão citoplasmática enfrenta limitações em termos de degradação proteica do estado não nativo e agregação a corpos de inclusão. Dos sete Fabs comercializados, dois são produzidos em E. coli na forma de corpos de inclusão3,7. O dobramento Fab é um processo complexo, envolvendo formação de ligações dissulfeto, isomerização cis-trans prolil e oligomerização controlada e, portanto, o redobramento de corpos de inclusões é frequentemente ineficiente e caro .

Os fragmentos Fab são compostos por duas cadeias polipeptídicas ligadas covalentemente, nomeadamente as cadeias pesada (HC) e leve (LC) que contêm respectivamente dois domínios constantes CH1 e CL e dois domínios variáveis ​​​​de ligação ao antigénio VH e VL (Fig. 1A). O domínio CH1 é uma proteína intrinsecamente desordenada isoladamente e permanece em estado desdobrado independentemente da formação de ligações dissulfeto9. Uma das etapas críticas limitantes da taxa no dobramento de fragmentos de anticorpos é a associação dos domínios constantes, já que o domínio CH1 adota a dobra típica da imunoglobulina (Ig) apenas na interação com o domínio CL9,10. Além disso, a baixa estabilidade do HC aliada à formação de dímeros de LC ligados covalentemente e não covalentemente justifica a necessidade de equilibrar a síntese das duas cadeias . Projetar e rastrear construções com diferentes forças de tradução de LC e HC para expressão ideal de Fab pode ser trabalhoso, caro e pode não necessariamente resultar em sucesso. Tem havido várias abordagens para conduzir a heterodimerização eficiente numa molécula Fab, por exemplo, Ojima-Kato et al. relataram a fusão de pares leucina-peptídeo zíper aos domínios constantes (Zipbody) . No entanto, isto limita a aplicação terapêutica de Fabs devido à necessidade de etapas de clivagem da etiqueta e subsequentes preocupações de imunogenicidade.